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發(fā)布時(shí)間:2021-02-19
 

銅綠假單胞菌為革蘭氏陰性桿菌,屬假單胞菌屬,在自然界廣泛分布,空氣、土壤水、人的皮膚、呼吸道、腸道都有分布。從《中國藥典》2015版1107非無(wú)菌藥品微生物限度標準可以看到,除口服給藥途徑的制劑外,其它給藥途徑劑型產(chǎn)品均有不得檢出銅綠假單胞菌的規定。那么在按照藥典規定進(jìn)行銅綠假單胞菌檢測、分離、及傳統方法鑒定的時(shí)候,您知道這些方法的原理是什么嗎?

 
 
 

 

 

 

01

溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基

Cetrimide Agar Medium

 

溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基 (Cetrimide Agar Medium) 是各國藥典普遍收載的控制菌檢查固體培養基, 用于銅綠假單胞菌的劃線(xiàn)分離培養。首先我們看一下溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基的配方和作用:

(1)營(yíng)養成分:銅綠假單胞菌分解蛋白質(zhì)能力較強,而發(fā)酵糖類(lèi)能力較低,在培養基組分中明膠胰酶水解物和甘油為銅綠假單胞菌的生長(cháng)提供碳、氮源、維生素和生長(cháng)因子。

(2)無(wú)機鹽:氯化鎂和硫酸鉀可以促進(jìn)綠膿菌素的產(chǎn)生,并維持滲透壓。

(3)選擇性培養的原理:溴化十六烷基三甲銨(cetrimide)作為一種季銨鹽陽(yáng)離子表面活性劑,通過(guò)改變細菌細胞的通透性,使細菌發(fā)生自溶或引起菌體蛋白質(zhì)變性沉淀,導致細菌死亡,有較強的抑菌作用。銅綠假單胞菌對溴化十六烷基三甲銨有一定的耐受性,因此,被用于銅綠假單胞菌的選擇培養。

(4)顏色:銅綠假單胞菌生長(cháng)過(guò)程中會(huì )產(chǎn)生兩種水溶性色素:黃色的熒光素和綠色的綠膿菌素,所以在溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上菌落呈黃綠色。

 

 

02

傳統生化鑒定方法

以疑似銅綠假單胞菌的溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養物或疑似菌分離純化的TSA培養物做后續生化試驗。

(1)氧化酶試驗

方法:挑取可疑菌落于潔凈的濾紙片上,滴加1%二鹽酸N,N-二甲基對苯二胺試劑,30秒內出現粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色,為氧化酶試驗陽(yáng)性反應。若培養物不變色或僅顯粉色為陰性反應。

原理:銅綠假單胞菌含有細胞色素氧化酶,該酶是細胞色素呼吸酶系統的最終呼吸酶。具有氧化酶的細菌,首先使細胞色素C氧化,再由氧化型細胞色素C使對苯二胺氧化,生成有色(如粉紅色或紫紅色)的醌類(lèi)化合物。

 

(2)綠膿菌素生成試驗

方法:挑取可疑菌落接種在在綠膿菌素測定用培養基(PDP)斜面上,培養24小時(shí),觀(guān)察斜面有無(wú)色素。如有色素,在試管內加氯仿3.0~5.0mL,充分震搖,使培養物中的綠膿菌素提取在氯仿中,待氯仿提取液呈現綠色時(shí),加1mol/L鹽酸約1mL,震搖后靜置片刻,上層鹽酸溶液中呈現粉紅至紅色實(shí)驗結果為陽(yáng)性,否則為陰性。

原理:銅綠假單胞菌能產(chǎn)生的綠膿菌素能被氯仿提取,且在水中溶解度比氯仿大,并且會(huì )發(fā)生可逆的氧化還原反應,氧化時(shí)堿性呈藍色,酸性呈紅色。所以加入鹽酸溶液并震搖后,綠膿菌素會(huì )由氯仿轉移至鹽酸溶液中,并在酸性環(huán)境中呈紅色。
 

(3)硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗

方法:取可疑菌落接種在含小導管的硝酸鹽蛋白胨水培養基內,35℃培養24小時(shí),小導管內有氣體產(chǎn)生實(shí)驗結果為陽(yáng)性,否則為陰性。

原理:銅綠假單胞菌是一類(lèi)兼性好氧、以有機碳作為能源的異養硝化菌,能通過(guò)產(chǎn)生的酶分四步還原硝酸鹽,將硝酸鹽分解產(chǎn)生氮氣。

 

(4)42℃生長(cháng)試驗

方法:以接種環(huán)沾取少許TSA培養物于0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中,制成菌懸液。將菌懸液劃線(xiàn)接種于TSA斜面上,置41±1℃培養培養24-48小時(shí),斜面上如有菌苔生長(cháng)為陽(yáng)性反應,無(wú)菌苔生長(cháng)為陰性反應。銅綠假單胞菌生長(cháng)實(shí)驗結果為陽(yáng)性。

原理:致病性銅綠假單胞菌能在42℃條件下生長(cháng),同屬的熒光假單胞菌和惡臭假單胞菌都不能生長(cháng)。

 

(5)明膠液化試驗

方法:取可疑菌落穿刺接種在明膠培養基內,35℃培養24小時(shí),取出后放2-8度冰箱10-30min,如果仍為液體,實(shí)驗結果為陽(yáng)性,否則為陰性。

原理:是利用銅綠假單胞菌產(chǎn)生胞外酶(明膠酶),使明膠分解為氨基酸,從而失去凝固力,半固體的明膠培養基成為流動(dòng)的液體。

 

 

03

結果及報告

(1)供試品培養物經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌,氧化酶試驗及綠膿菌素試驗皆為陽(yáng)性者,即報告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌;
(2)供試品培養物氧化酶陽(yáng)性,鏡檢革蘭氏陰性桿菌,綠膿菌素試驗陰性時(shí)硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗,42℃生長(cháng)試驗及明膠液化試驗皆為陽(yáng)性時(shí),報告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌;
(3)與(1)和(2)結果不符,報告1g或1ml供試品未檢出銅綠假單胞菌。


原文鏈接:中國藥典中銅綠假單胞菌的檢驗及分離鑒定原理。

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